תעלות מרצפות
תעלות מרצפות (Nanopore sequencing ) היא שיטת ריצוף ביופולימרים מהדור השלישי ומשמשת בעיקר לריצוף DNA או RNA.
השיטה מבוססת על חדירת הגדילים המרוצפים דרך חֲרִיר בקוטר של ננומטרים בודדים (תעלה יונית) בממברנה טבעית או מלאכותית, הנמצאת בתוך תמיסה פיזיולוגית. שינויים חשמליים בתמיסות בין שני צדדי הממברנה או בחריר עצמו תלויים בסוג הבסיס החודר, מדידת השינויים מאפשרת את זיהוי הבסיס. באופן זה ניתן לרצף את הגדיל השלם.
היסטוריה
הרעיון של ריצוף DNA בשיטת תעלות מרצפות הוצע בתחילת שנות ה-90 של המאה ה-20[1][2]בידי שתי קבוצות שעבדו באופן עצמאי: האחת בראשות Mark Akeson והשנייה בראשות Jens Gundlach. שתי הקבוצות גילו שניתן להעביר מולקולת DNA יחידה דרך תעלה חלבונית ביולוגית וכי זרם יונים שנמדד מהתעלה המרצפת בעת מעבר המולקולה דרך התעלה נותן מידע על רצף הנוקלאוטידים של המולקולה.
שיטת תעלות מרצפות
עיקרון הריצוף בעזרת תעלות, מבוסס על כך ש-DNA חד-גדילי עובר דרך תעלה, והזרם היוני הנמדד, מעיד על סוג הנוקלאוטיד (אדנין (A), ציטוזין (C), גואנין (G) או תימין (T)) העובר בתעלה ברגע זה.
ריצוף בעזרת תעלות נעשה על ידי זיהוי האות החשמלי שנמדד מהתעלה בעזרת רישום אלקטרופזיולוגי של מתח הממברנה. האות החשמלי הוא פונקציה של הזרם היוני, המעיד על סוג הנוקלאוטיד[3][4].
ישנם שלושה עקרונות חשובים לביצוע מדידות אלקטרופזיולוגיות באמצעות תעלה:
- מעבר יונים דרך התעלה כתלות במעבר הבסיסים דרכה.
- התעלה צריכה להיות מספיק גדולה בשביל להכיל גם את המולקולה הנמדדת וגם את היונים שעוברים בתוכה. יש להתחשב גם בתכונות הידרו-דינמיות של היונים.
- על הרישום להיות רגיש מספיק ובעל יחס אות-רעש סביר בשביל לדווח על ההבדל הקטן ביותר במולקולות ה-DNA שעוברות אנליזה, לדוגמה: היכולות להבחין בין מולקולות DNA בעלות מתילציה לבין כאלו החסרות אותה.
מעבר היונים בתוך התעלה הוא מהיר יותר מהמעבר של המולקולה הנמדדת. בכל 1μs (מיקרו-שנייה) של מעבר נוקלאוטיד ממולקולת ה-DNA בתוך התעלה מתקבל זרם של 20pA (פיקו-אמפר), שהוא שווה ערך למעבר של 124 יונים. כאשר מופיע זרם בתוך הממברנה שמכילה את התעלה, מתרחשות באלקטרודות שתי תגובות אלקטרוכימיות הפיכות:
בממברנה, היונים משתתפים גם ביצירת האות החשמלי הנמדד מהתעלה וגם ביצירת סיגנל הרעש. המדידה בתעלה מתקבלת בעקבות היונים שעוברים בתוך התעלה ומשלימים את המעגל האלקטרוכימי. לכל אחד מהנוקלאוטידים ישנה תגובה אופיינית לו, כלומר נמדד זרם שונה מהתעלה. כאשר נוקלאוטידים מסוג פורין יעברו בתוך התעלה נקבל סיגנל עמוק יותר ממעבר של נוקלאוטידים מסוג פרמידנים בתוך התעלה[3][5].
סוגים של תעלות מרצפות
הסוגים העיקריים של ריצוף בעזרת תעלות הם- התעלות הביולוגיות (Biological nanopores) ותעלות במצב מוצק[5] (solid-state nanopores).
תעלות ביולוגיות
התעלות הביולוגיות (Biological nanopores) הן חלבונים היוצרים נקבוביות בממברנה שומנית, דרכן יכולות לעבור מולקולות DNA. לתעלות הביולוגיות מספר יתרונות לאנליזת מולקולת DNA בודדת:
- תאים יכולים לייצר מספר רב של תעלות, בדיוק אטומי העולה על ייצור תעלות בדרך התעשייתית.
- הגודל וההרכב של התעלות יכול להשתנות על פי הצורך.
- ניתן להתאים את המאפיינים הכימיים והפיזיים של התעלות לפי השימוש הנצרך.
אחד מהחלבונים הנפוצים בסוג זה של תעלות הוא (a-hemolysin pore (a-HL שקוטרו הפנימי הוא כ- 2 ננומטר (2nm). תעלה זו מורכבת מ-7 תת-יחידות מונומריות, שהופקה מ-Staphylococcus aureus. ייחודה של התעלה, מתבטא בכך שהיא נותרת פתוחה ב- pH נייטרלי ובמתח יוני גבוה.
תעלות במצב מוצק
תעלות במצב מוצק (solid-state nanopores) עשויות לרוב מסיליקון, כאשר הסיליקון הנפוץ ביותר הוא סיליקון ניטריד. דרך ייצור התעלות, נעשה בשיטות שונות, כמו פיסול בעזרת קרן יונים ואלומות אלקטרונים. תעלות מסוג זה, יוצרו לראשונה ב-2001, והפכו לאלטרנטיבה זולה ויעילה לתעלות הביולוגיות. היתרונות בשיטה הזו הן:
- היכולת להתאים את הגודל והצורה של התעלה לפי הצורך, בדיוק רב.
- לתעלות אלו עמידות רבה לאורך זמן.
- היכולת לייצר אותן בצפיפות גבוהה, תוך התאמה מעולה של מאפיינים מכניים, כימיים ותרמיים לעומת תעלות ביולוגיות.
- תעלות אלו מאפשרות שילוב עם טכנולוגיית קריאת בסיסים אופטית ואלקטרונית[6][7][8] .
יתרונות השיטה
ריצוף בעזרת תעלות מרצפות מאפשר לרצף מקטעי DNA ארוכים. יתרון זה יאפשר בעתיד לרצף מולקולת DNA גנומית בזמן קצר ובאופן יעיל תוך כדי קבלת מידע על שינויים שחלו ברצף הגנטי כמו מקטעים שהוספו, מקטעים שהוסרו וכו'. למעשה, ריצוף בשיטה זו אינו מוגבל באורך ה-DNA. לשיטה זאת יתרון נוסף שכן, ניתן להשתמש בתעלה אחת לסוגים רבים של מולקולות DNA, כלומר השיטה אינה ספציפית אלא גנרית ולכן אינה דורשת הכנות מוקדמות, הגברה של המקטע וכדומה[9][10]. יתרונותיה העיקריים של השיטה הם מהירות הריצוף ועלותו הנמוכה, הואיל והשיטה אינה דורשת שימוש באנזימים, כגון DNA פולמראז או בנוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית, אך חסרונה העיקרי הוא אחוז שגיאה גבוה.
ייעול עתידי של המערכת
נניח כי קיימת תעלת מרצפת אידיאלית שניתן להעביר בה מולקולת DNA. התעלה לא יוצרת אינטראקציה חזקה עם ה-DNA היא רק רחבה מספיק בשביל להכיל את מולקולת ה-DNA ואת זרם היונים שעובר בתוכה במהלך ריצוף ה-DNA. בנוסף, כל נוקליאוטיד מספק זרם יונים שונה במהלך מעבר בתוך התעלה. השאלה שעולה מתוך הנחה זאת ונשאלה על ידי חוקרים בנושא זה על מנת לפתח את הנושא ולהפוך את החזון למציאות: האם תעלה יונית מסוגלת באופן ישיר לרצף גדיל של מולקולות DNA? על מנת שהחזון יהפוך למציאות יש להתמודד ולהמשיך לחקור את הקשיים שעלו בדרך.
מעבר מונחה מתח של פולינוקליאוטיד בתוך התעלה הוא מאוד פשוט, עדיין התנאים המיקרוסקופים של המעבר של הגדיל בתוך התעלה לא נשלטים באופן מלא בגלל מגבלות פנימיות של תהליך ההעברה בתוך התעלה. לדוגמה, תהליך הדיפוזיה הטבעית לתוך התעלה עדיין לא נחקר באופן משמעותי מספיק בשביל להגיע למסקנות לגבי תהליך זה. בנוסף, תהליך המעבר של המולקולה הוא מהיר מאוד וכמעט בלתי ניתן למדידה. הפחתת המתח של המעבר מגדיל את זמני המעבר הממוצעים, אך תהליך הדיפוזיה (שמגביר את הרעש של המערכת) הופך לאיטי יותר אך גם לתהליך פחות מבוקר ומסודר. תוצאה זאת משאירה את החוקרים עם מידע בלתי מספק לקביעת רצף גדיל ה-DNA מסיבות שאינן בשליטתם.
בשביל לנסות ולפתור את בעיית המעבר ניסו להשתמש בדופלקס של DNA לא מזווג. הקינטיקה של התהליך צריכה להיות יותר מבוקרת בעזרת בחירת מתח התעלה וגודל הדופלקס. למרות זאת, DNA לא מזווג לא יכנס לתוך התעלה בסיס אחר בסיס בשל המבנה של הדופלקס שהוא מבנה יציב יותר הבנוי מכמה נוקלאוטידים אשר לא מאפשרים את המעבר בתוך התעלה באופן של בסיס אחר בסיס. המסקנה הנ"ל מצריכה את החוקרים להרחיב את החומצות האמינו הפנימיות וכתוצאה מכך זמן הריצוף מתארך. משימה זאת יכולה להיות מאתגרת מאוד בעיקר מהסיבה שיש את הצורך להגדיל את הפוטנציאל של התעלה המרצפת לקרוא מקטעים ארוכים יותר ולאורך זמן ארוך יותר.
השימוש בשיטה של "צעד מוטורי תלוי אנזים" היא עוד דרך לוויסות המעבר בתוך התעלה. לפי שיטה זאת האנזים DNA פולימראז משמש בשביל להניע את גדיל ה-DNA הבודד להיכנס לתוך התעלה בסיס אחד בכל פעם, כך שגדיל ה-DNA נמשך לתוך התעלה בעזרת כוחות חשמליים. למעשה התהליך הוא סימולטני בעוד שה-DNA פולימראז מפלמר את גדיל ה-DNA מנקלאוטידים אשר בתמיסה הגדיל עצמו "משתחל" דרך התעלה המרצפת, בכל פעם שהאנזים משלב נוקליאוטיד לשרשרת, נוקליאוטיד אחד נדחף לתוך התעלה. ניתן לבקר את היעילות של האנזים בעזרת שינוי הריכוז של הנוקלאוטידים בתמיסה, שינוי המתח או בחירה של אנזים פולימראז שונה ויותר יעיל למדידה. היתרון של "צעד מוטורי תלוי אנזים" יכול להוות התקדמות גדולה תחום ולהוות פתרון יעיל לריצוף מולקולת DNA ארוכה במעט זמן ובכמה שפחות משאבים[3].
ראו גם
קישורים חיצוניים
הערות שוליים
- ^ Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., & Deamer, D. W. (1996). Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(24), 13770-13773.
- ^ Church, George, et al. "Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions." U.S. Patent No. 5,795,782. 18 Aug. 1998.
- ^ 3.0 3.1 3.2 Wanunu, M. (2012). Nanopores: A journey towards DNA sequencing. Physics of life reviews, 9(2), 125-158.
- ^ Atas, E., Singer, A., & Meller, A. (2012). DNA sequencing and bar‐coding using solid‐state nanopores. Electrophoresis, 33(23), 3437-3447.
- ^ 5.0 5.1 Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., & Bayley, H. (2009). Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(19), 7702-7707.
- ^ Venkatesan, B. M., & Bashir, R. (2011). Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nature nanotechnology, 6(10), 615-624.
- ^ Branton, D., Deamer, D. W., Marziali, A., Bayley, H., Benner, S. A., Butler, T., ... & Jovanovich, S. B. (2010).The potential and challenges of nanopore sequencing. In Nanoscience and technology: A collection of reviews from Nature Journals (pp. 261-268).
- ^ Healy, K., Schiedt, B., & Morrison, A. P. (2007). Solid-state nanopore technologies for nanopore-based DNA analysis. Nanomedicine (London, England), 2(6), 875.
- ^ Clarke, J., Wu, H. C., Jayasinghe, L., Patel, A., Reid, S., & Bayley, H. (2009). Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing. Nature nanotechnology, 4(4), 265-270.
- ^ Schneider, G. F., & Dekker, C. (2012). DNA sequencing with nanopores. Nature biotechnology, 30(4), 326-328.
