Pyrosequencing
פירוסיקוונסינג (Pyrosequencing) היא שיטה לריצוף DNA (קביעת סדר הנוקליאוטידים בדנא) המבוססת על עקרון ה"ריצוף באמצעות סינתזה".
שיטה זו שונה מריצוף סנגר בכך שהיא נשענת על זיהוי של שחרור פירופוספט בעת הוספת נוקליאוטיד, בעוד ששיטת סנגר מסתמכת על סיום שרשרת עם דידיאוקסינוקליאוטידים. השיטה פותחה על ידי מוסטפא רונגי ופל ניירן במכון המלכותי לטכנולוגיה בסטוקהולם בשנת 1996.
באמצעות השיטה ניתן לקבוע מהו רצף ה־DNA המבוקש באמצעות אור המשתחרר כאשר הנוקליאוטיד המשלים הבא מתווסף לרצף. הקביעה מתאפשרת הודות לעובדה שרק אחד מתוך 4 נוקליאוטידים – A,C,T ו-G יכול להיווסף ולהיות זמין בכל פעם, ולכן רק אות אחת יכולה להשתלב ברצף ה־DNA החד-גדילי (הרצף שמנסים לקבוע). עוצמת האור מלמדת אם יש יותר מאחת מאותן "אותיות" ברצף. הנוקליאוטיד הקודם ברצף (אחד מתוך 4 dNTP אפשריים) מפורק לפני שהאות הבאה מתווספת לסינתזה ובכך מתאפשרת חשיפת הנוקליאוטיד הבא כתלות בעוצמת האור (אם הנוקליאוטיד שנוסף אכן היה האות המשלימה הבאה ברצף). תהליך זה מתבצע שוב ושוב עם כל אחת מארבע האותיות עד שרצף ה־DNA של התבנית החד גדילית נקבע.
פרוצדורה
"ריצוף על ידי סינתזה" מערב נטילת גדיל בודד של ה־DNA שמעוניינים לרצף וסינתזה של הגדיל המשלים שלו על ידי אנזימים. שיטת ה-pyrosequencing מבוססת על זיהוי הפעילות של DNA פולימראז (אנזים המסנתז DNA) באמצעות אנזים כימולומינסטי (המקיים תגובה בה נוצר אור בלי חום) אחר. בעיקרו של דבר, השיטה מאפשרת ריצוף של גדיל DNA בודד על ידי סינתזת הגדיל המשלים שלו לאורכו, זוג בסיסים אחד בכל פעם, וזיהוי הבסיס שנוסף בכל שלב. גדיל ה־DNA המשמש כתבנית יציב ותמיסות של הנוקליאוטידים A, C, T ו-G מוספות ומוסרות מהתגובה עמו באופן רציף. אור נוצר רק כאשר תמיסת הנוקליאוטיד משלימה את הבסיס הלא מזווג הראשון של רצף התבנית. רצף התמיסות המייצרות אותות כימולומינסטיים מאפשרות את קביעת הרצף של הגדיל המשמש כתבנית.
גדיל ה־DNA הבודד המשמש כתבנית מוכלא לתוך פריימר ריצוף ומודגר עם האנזימים DNA פולימראז, ATP סולפורילאז, לוציפראז ואפיראז ועם הסובסטרטים אדנוזין 5' פוספוסולפט (APS) ולוציפרין.
- הוספת אחד מארבעת הטריפוספטים הדיאוקסינוקליאוטידים (dNTPs) (dAPTaS, שאינו סובסטרט של לוציפראז מוסף במקום dATP כדי להימנע מרעש) מאתחלת את השלב השני. DNA פולימראז משלב את ה-dNTP הנכון, המשלים לתוך התבנית. שילוב זה מוביל לשחרור פירופוספט (PPi).
- ATP סולפורילאז ממיר את הפירופוספט ל-ATP (אדנוזין טרי-פוספט) בנוכחות האדנוזין 5' פוספוסולפט. ATP זה מתפקד כסובסטרט עבור ההמרה מתווכת הלוציפראז של לוציפרין לאוקסילוציפרין המייצרת אור נראה בכמויות פרופורציונליות לכמות ה-ATP. האור הנוצר בתגובה שמאיץ הלוציפראז נקלט על ידי מצלמה ומנותח על ידי פירוגרם.
- נוקליאוטידים שלא שולבו וכן ה-ATP מפורקים על ידי האפיראז והריאקציה יכולה להתחיל מחדש עם נוקליאוטיד אחר.
מגבלה של השיטה היא שאורכי הקריאות האינדיבידואליות של רצף DNA הן באזור ה-300–500 נוקליאוטידים, קצרות יותר מאלו באורכים של 800–1000 נוקליאוטידים שניתן להשיג בשיטות מסוג סיום שרשרת (chain termination) (לדוגמה – סנגר). עניין זה יכול להפוך את הרכבת הגנום לקשה יותר, במיוחד עבור רצפים הכוללים כמות גדולה של DNA חוזרני. נכון לשנת 2007, pyrosequencing משמשת בעיקר לריצוף חוזר או לריצוף גנומים שעבורם כבר קיים רצף של קרוב משפחה קרוב.
את התבניות עבור pyrosequencing ניתן לייצר הן באמצעות יצירת תבנית שלב מוצק (סטרפטווידין – חרוזים מגנטיים מצופים) ויצירת תבנית אנזימטית (אפיראז + אקסונוקליאז). דהיינו, ניתן להפריד Pyrosequencing לשני סוגים הנקראים Pyrosequencing של השלב המוצק ו- Pyrosequencing של השלב הנוזלי.
מיסחור
החברה Pyrosequencing AB שבאופסלה, שוודיה נוסדה באמצעות קרן הון סיכון שניתנה על ידי HealthCap במטרה להפוך מכונות וריאגנטים לריצוף רצפי דנא קצרים תוך שימוש בטכניקת ה- pyrosequencing למסחריים. Pyrosequencing AB הייתה רשומה בבורסת סטוקהולם ב-1999. שם החברה הוחלף ל-Biotage ב-2003. קו עסקי ה- pyrosequencing נרכש על ידי קיאגן ב-2008. טכנולוגיית ה-pyrosequencing ניתנה ברישיון לחברה 454 life sciences. 454 פיתחה טכנולוגיית pyrosequencing מבוססת מערך (array) שיצאה כפלטפורמה לריצוף DNA בקנה מידה רחב. הראויים ביותר לציון הם היישומים לריצוף גנום ולמטגנומיקה. GS-FLX, פלטפורמת ה- pyrosequencing האחרונה שייצרה 454 יכולה לייצר 400 מגה-בייט בריצה של 10 שעות באמצעות מכונה אחת. עלות כל ריצה כזאת היא בין 5000–7000 דולרים אמריקאים.[דרוש מקור] פלטפורמה זו היא כעת בבעלות החברה Roche Diagnostics.
בשנת 2013 הכריז הופמן לה-רוש על הפסקת ייצור פלטפורמת הריצוף 454.
לקריאה נוספת
- "Definition of pyrosequencing from the Nature Reviews Genetics Glossary". Retrieved 2008-10-28.
- Ronaghi; Uhlén, M; Nyrén, P (1998-07-17). "A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science. 281 (5375): 363. PMID 9705713. doi:10.1126/science.281.5375.363.
- Ronaghi; Karamohamed, S; Pettersson, B; Uhlén, M; Nyrén, P (1996). "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry. 242 (1): 84–9. PMID 8923969. doi:10.1006/abio.1996.0432.
- Nyrén, P. (2007). "The History of Pyrosequencing". Methods Mol Biology. 373: 1–14. PMID 17185753. doi:10.1385/1-59745-377-3:1.
- Qiagen acquires Biotage
